O estanozolol é intensamente metabolizado e os seus metabolitos urinários podem ser detectados durante muito mais tempo do que o progenitor. A deteção e confirmação do abuso de estanozolol no desporto é difícil devido aos baixos níveis de excreção dos metabolitos urinários combinado com a ocorrência de elevado background biológico e as elevadas interferências das matrizes biológicas na cromatografia, nomeadamente no tempo de eluição. [17]

 

   Os principais produtos metabólicos de fase I, importantes para efeitos de controlo de dopagem humanos, são 3’-hidroxiestanozolol, 4-β-hidroxiestanozolol, 16β-hidroxiestanozolol e 4,16-di-hidroxi-estanozolol. Estes são excretados na urina como conjugados de glucuronido pelo que é aplicada a hidrólise enzimática antes da sua extracção. Antes da introdução da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS), a detecção era realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS). No entanto LC-MS é hoje a primeira escolha para a detecção de metabolitos de estanozolol na urina, tanto de humanos como de origem animal, porque não é necessário derivatizar e o anel pirazol é facilmente ionizado durante o processo de electrospray ionization interface. [18]

    Na análise de doping humano a monitorização de 4,16-di-hidroxi-estanozolol em negative electrospray ionization tem demonstrado ser muito atractiva para a detecção a longo prazo de abuso stanozolol. Infelizmente não está disponível nenhum padrão para este composto pelo que a confirmação de uma amostra suspeita é feita através da comparação do tempo de retenção e espectro de massa numa amostra suspeita com uma amostra de referência ​​(urina). [18]

     A maioria dos procedimentos de identificação dos metabolitos utiliza hidrólise enzimática e métodos de extração usando extração simples/múltipla líquido-líquido (LLE) ou extração em fase sólida única/múltipla (SPE) ou combinações de ambas. Em 2013 um método sensível para a detecção do 3’-hidroxiestanozolol conjugado com glucuronido foi validado, com a omissão do passo de hidrólise enzimática, baixo efeito da matriz e extracção de elevada extracção contribuindo para a sensibilidade do ensaio. Levando-se em conta critérios de identificação da WADA (World Anti-Doping Agency) de 2 ng/ml de urina, foi obtido um limite de deteção de 50 pg/ml de urina. [18]